3 bước tuần tự hàng đầu của phản ứng chuỗi polymerase (PCR)

Các điểm sau đây nêu bật ba bước tiếp theo hàng đầu của phản ứng chuỗi polymerase (PCR). Các bước tiếp theo là: Khử nhiễu 2. Ủng hộ 3. Mở rộng DNA.

Bước tuần tự # 1. Biến tính:

Bước đầu tiên là làm biến tính DNA (cả DNA Primer và DNA bản địa). Tách hai chuỗi DNA được gọi là biến tính trong khi mang hai chân đứng lại với nhau được gọi là tái ủ hoặc lai hóa (Hình 48.1). Việc phát hiện biến tính và tái ủ DNA được tạo ra một cách nhân tạo bởi Marmor và Lane (1960).

Theo họ, DNA sợi kép có thể được tách thành hai chuỗi riêng biệt (biến tính) bằng cách nung ở nhiệt độ cao (90-95 ° C) và lai hoặc nối hai chuỗi DNA (DNA sợi kép) có thể bằng giảm nhiệt độ (50-56 ° C).

Đây là nguyên tắc chính mà chức năng PCR. Nguyên tắc thứ hai là mở rộng đoạn mồi với sự trợ giúp của enzyme DNA polymerase.

DNA tự nhiên, mồi và enzyme DNA polymerase (Tag polymerase) được thêm vào trong ống PCR và nhiệt độ được tăng và giảm trong máy PCR để làm biến tính và lai hóa.

Bước tuần tự # 2. Ủng hộ:

Sau khi làm biến tính DNA, bước tiếp theo là cho phép mồi tổng hợp để ủ với các chuỗi DNA đối diện của chuỗi mục tiêu mong muốn. Ủ (lai) có thể xảy ra nếu nhiệt độ từ 95 ° C hạ xuống 50/56 ° C. Nhiệt độ sau đó được đưa xuống trong máy.

Ngay khi nhiệt độ hạ thấp, các chuỗi DNA tự nhiên sẽ liên kết không chỉ với nhau mà còn liên kết các đoạn mồi. Sự lai hóa cụ thể này hay còn gọi là tái tổ hợp của các nucleotide bổ sung, cung cấp cả cơ sở lý luận và cơ sở thực tiễn cho phần lớn DNA tái tổ hợp (Hình 48.2).

Bước tuần tự # 3. Mở rộng DNA (Cần có enzyme Taq polymerase):

Sau khi các mồi đã được ủ, chúng nên được mở rộng bằng cách sử dụng mồi oligonucleotide làm điểm bắt đầu. mô tả rằng enzyme DNA polymerase là cần thiết cho quá trình tổng hợp DNA. Do đó, để mở rộng mồi chúng ta cần một DNA polymerase ổn định nhiệt để enzyme không bị phá hủy ở nhiệt độ cao.

Các polymerase ổn định nhiệt (Taq polymerase) được phân lập từ Thermus Aquus. Taq polymerase có lợi thế rất lớn trong việc thực hiện phản ứng PCR. Nó có nhiệt độ hoạt động tối ưu khoảng 70 ° C và không được thêm enzyme tươi vào mỗi ống nghiệm sau quá trình làm nóng và làm mát.

DNA polymerase ổn định nhiệt hiện được sản xuất bởi các công ty khác nhau với các nguồn khác nhau (trừ Thermus Aquus) dưới các tên thương mại khác nhau (TM). Để mở rộng mồi, DNA polymerase ổn định nhiệt được thêm vào trong ống và nhiệt độ sau đó được nâng lên 65-70 ° C.

Các chu kỳ tiếp theo của tách chuỗi (biến tính), lai hóa mồi (ủ) và tổng hợp chuỗi (mở rộng) đảm bảo khuếch đại theo cấp số nhân của chuỗi mục tiêu bằng cách sử dụng chuỗi khuếch đại nếu chu kỳ trước làm mẫu mới, có ba chu kỳ (Hình 48.2 ).

Làm mồi:

Các đoạn mồi là chuỗi ngắn (thường là RNA) được sử dụng để tạo ra hai nucleotide, được gọi là mồi, với một cho mỗi đầu của đoạn DNA và cung cấp một đầu 3 -OH miễn phí, trong đó DNA polymerase bắt đầu tổng hợp chuỗi deoxyribonucleotide.

Một chuỗi được thực hiện theo hướng cảm giác, trong khi chuỗi khác được thực hiện theo hướng chống giác quan. (Hình 48.2). Đoạn mồi được sử dụng để tổng hợp các chuỗi DNA miễn phí và được thiết kế sao cho DNA giữa các đoạn mồi là đoạn quan tâm được khuếch đại.

Nếu RNA thông tin (mRNA) được khuếch đại, nó phải được chuyển đổi thành DNA miễn phí (cDNA) bằng DNA polymerase phụ thuộc RNA, sao chép ngược. Phức hợp cDNA sau đó được thay đổi thành DNA sợi kép, trở thành khuôn mẫu cho phản ứng PCR tiếp theo.

Điều này thường được gọi là phản ứng chuỗi transcriptase polymerase đảo ngược (RT PCR). Các mồi có thể được tạo ra một cách nhân tạo hoặc có thể được mua từ các công ty.

Sau khi phản ứng kết thúc, các sản phẩm khuếch đại (DNA) có thể được hình dung bằng điện di gel. Tính chất vật lý quan trọng của phân tử DNA là mỗi nucleotide riêng lẻ có điện tích âm do nhóm photphat.

Do đó, các mảnh có kích thước khác nhau tiếp xúc với điện trường có xu hướng di chuyển về phía điện cực dương với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào kích thước, với các mảnh nhỏ di chuyển nhanh hơn so với điện cực lớn hơn. Quá trình phân tách dựa trên điện tích này được gọi là điện di.

Các mẫu DNA, sau khi được tiêu hóa thành các mảnh có kích thước khác nhau bằng enzyme hạn chế (endonuclease), được thêm vào để hỗ trợ môi trường như gel agrose hoặc acrylamide. Các lỗ chân lông của gel phụ thuộc vào tỷ lệ phần trăm của nó và có thể được so sánh với một sàng (phân tử). Do đó, tốc độ di chuyển của các đoạn DNA thông qua gel phụ thuộc vào cả kích thước đoạn DNA và điện áp ứng dụng.

Thủ tục để tách và khấu trừ đoạn DNA cụ thể là vết rộp phía Nam. Tầm quan trọng của kỹ thuật này là mảnh sợi đơn có thể được chuyển bằng tác động mao dẫn sang môi trường hỗ trợ rắn (màng nylon hoặc cellulose) và cố định vĩnh viễn bằng cách gia nhiệt (Hình 48.3).

Sau khi điện di, mẫu DNA có thể được hình dung dưới đèn UV sau khi xử lý bằng vết bẩn ethidium bromide; ethidium bromide là thuốc nhuộm huỳnh quang. Điện di gel agrose phân biệt các mảnh từ 100 cặp cơ sở đến 60000 cặp cơ sở (60 kb) trong khi đó, gel polyacrylamide phân tách hiệu quả các mảnh hơn 1000 cặp cơ sở (1 kb).

Điện di trên gel xung (PFGE) đã có thể phân tách các đoạn DNA thậm chí lên tới 2kb. Trong thủ tục này, điện trường bị thay đổi theo các hướng khác nhau buộc các phân tử DNA phải định hướng lại giữa mỗi xung hoặc dòng điện. Đây là kỹ thuật tốt nhất để xác định một gen đã biết.

Các endonuclease có thể nhận ra 3, 4, 5, 6 hoặc 8 cặp cơ sở và có sẵn trên thị trường.

Dung dịch đệm / muối PCR.

Đối với Taq DNA polymerase, bộ đệm được thực hiện như sau:

50 mM KCI

10 mM Tris-HCI ở nhiệt độ phòng

Dimethyl sulphoxide (DMSO) và glycol được sử dụng làm đồng dung môi trong bộ đệm PCR khi mục tiêu có nhiệt độ biến tính rất cao.

Deoxynucleotide triphosphate (dNTPs) là đồng yếu tố ion.

Bây giờ các công ty công nghệ sinh học đang cung cấp các giải pháp chuẩn bị.

Nguyên tắc cơ bản được mô tả như sau:

Có bốn dNTP là dATP (adenine triphosphate), dCTP (cytosine), dGTP (gunine), dUTP (uracil) được sử dụng theo quy tắc cặp cơ sở để mở rộng chuỗi mồi

Các dNTP liên kết với Mg ²⁺ . Lượng dNTP có trong một phản ứng sẽ quyết định lượng Mg ²⁺ tự do có sẵn cho hoạt động enzyme tối ưu. Các dung dịch dNTP gốc phải được trung hòa với cơ sở Tris đến pH 7.0 và nồng độ của chúng phải được xác định bằng phương pháp đo quang phổ.

Chất nền và chất nền tương tự:

Taq polymerase hoạt động (dNTP) rất hiệu quả. Tuy nhiên, có một số chất nền được sửa đổi có sẵn thay cho chất nền Tag DNA polymerase. Chúng là dogoxigenin-dNTP, biotin-11-dUTP, C7deaza-dGTP và dNTPS có nhãn huỳnh quang.

Các loại PCR sau đây được sử dụng chung:

(1) PCR lồng nhau;

(2) RT-PCR;

(3) PCR neo;

(4) PCR không đối xứng;

(5) PCR nghịch đảo;

(6) DOP-PCR.