Thí nghiệm nuôi cấy và liệt kê vi khuẩn
Thử nghiệm để nuôi dưỡng và liệt kê vi khuẩn!
Nguyên tắc:
Việc đình chỉ vi khuẩn, mẫn cảm với vi khuẩn (vi rút lây nhiễm vi khuẩn) được gieo mầm với vi khuẩn đó và được phép phát triển như một bãi cỏ hợp lưu trên đĩa thạch.
Các hạt vi khuẩn phát triển trong các tế bào vi khuẩn và ly chúng. Sự phân giải của các tế bào vi khuẩn dẫn đến sự hình thành các vùng rõ ràng trong bãi cỏ của vi khuẩn. Những vùng rõ ràng này được gọi là "mảng". Mỗi vùng rõ ràng được giả định là được hình thành bởi một hạt vi khuẩn duy nhất. Do đó, số lượng đơn vị hình thành mảng bám (PFU) đại diện cho số lượng vi khuẩn.
Kỹ thuật pha loãng nối tiếp được sử dụng trong việc liệt kê các vi khuẩn tương tự như sử dụng trong liệt kê vi khuẩn. Số lượng các hạt phage có trong một mẫu được xác định bằng cách đếm số lượng mảng được hình thành trên đĩa thạch hạt giống và nhân số này với hệ số pha loãng.
Để xác định số lượng phage hợp lệ, số lượng mảng trên mỗi tấm không được vượt quá 300 cũng không dưới 30. Các tấm hiển thị lớn hơn 300 PFU được gọi là "quá nhiều để đếm" (TNTC), trong khi các tấm có ít hơn 30 PFU được gọi là 'quá ít để đếm' (TFTC).
Vật liệu thiết yếu:
Tryptone broth, tryptone soft agar, tryptone hard agar, bình nón, ống nghiệm, đĩa petri tiệt trùng, phích cắm bông, nuôi cấy vi khuẩn (Ví dụ: T 2 coliphage), nuôi cấy nước canh dinh dưỡng của vi khuẩn (Ex: Escherichia coli B), pipet tiệt trùng, nồi hấp, tắm nước nóng, lò đốt bunsen, buồng chảy tầng, bình vứt bỏ, lồng ấp.
Thủ tục:
1. Mười lăm pipet (trong hộp đựng bằng thép không gỉ) và năm đĩa petri được khử trùng trong lò không khí nóng ở 180 ° C trong 3 giờ. Ngoài ra, chúng có thể được phủ bằng giấy thủ công, buộc bằng chỉ hoặc dây cao su và khử trùng trong nồi hấp cùng với phương tiện truyền thông (Hình 8.3).
2. Các thành phần của môi trường nước dùng tryptone hoặc bột làm sẵn của nó, cần cho 100 ml nước dùng được cân và hòa tan trong 100 ml nước cất trong bình nón 250 ml bằng cách lắc và xoay. Độ pH của nó được điều chỉnh thành 7, 5 bằng cách sử dụng 0, 1N HCI hoặc 0, 1N NaOH theo yêu cầu. Bình được làm nóng, nếu cần, để hòa tan hoàn toàn các thành phần.
3. Nước dùng được phân phối thành 10 ống nghiệm (mỗi ống 9 ml), cắm bông, phủ giấy thủ công và buộc bằng chỉ hoặc dây cao su.
4. Các thành phần của môi trường thạch mềm tryptone hoặc bột làm sẵn của nó, cần cho 100 ml môi trường được cân và hòa tan trong 100 ml nước cất trong bình nón 250 ml bằng cách lắc và xoay. Độ pH của nó được điều chỉnh thành 7, 5 bằng cách sử dụng 0, 1N HCI hoặc 0, 1N NaOH theo yêu cầu. Bình được đun nóng để hòa tan agar trong môi trường hoàn toàn.
5. Môi trường chất lỏng này được phân phối thành 5 ống nghiệm (mỗi ống 2 ml), cắm bông, phủ giấy thủ công và buộc bằng chỉ hoặc dây cao su.
6. Các thành phần của môi trường agarone cứng hoặc bột làm sẵn cần cho 100 ml môi trường được cân và hòa tan trong 100 ml nước cất trong bình nón 250 ml bằng cách đun nóng sau khi điều chỉnh pH đến 7, 5. Bình được cắm bằng bông, phủ giấy thủ công và buộc bằng chỉ hoặc dây cao su.
7. 10 ống canh tryptone, 5 ống thạch mềm tryptone và bình chứa môi trường thạch cứng tryptone được khử trùng ở 121 ° C (áp suất 15 psi) trong 15 phút trong nồi hấp.
8. Môi trường thạch cứng tryptone đã khử trùng trong bình nón được rót vào 5 đĩa petri tiệt trùng vô trùng để lấy 5 đĩa thạch cứng tryptone.
9. Một ml môi trường nuôi cấy vi khuẩn (Ví dụ: T 2 coliphage) được truyền vô trùng, tốt nhất là trong buồng chảy tầng, vào ống canh tryptone (9 ml) bằng pipet tiệt trùng. Điều này trở thành độ pha loãng 10 lần (tức là 10 -1 ). Đây là pha loãng vô trùng huyết thanh vào chín ống canh khác, để có được độ pha loãng cuối cùng là 10 -10 (Hình 8.4).
10. 5 ống thạch mềm tryptone đã khử trùng được lấy và đun nóng trên nồi cách thủy đến 100 ° C, để làm tan chảy thạch. Các ống được làm mát và các ống mềm mềm nóng chảy được duy trì ở 45 ° C.
11. Trong số 10 ống trên có chứa các phage ở các nồng độ khác nhau, năm ống (tức là 10 -5, 10 -6, 10 -7, 10 -8 và 10 -9 ) được chọn. Từ các ống này, mỗi ống vô trùng 1 ml được chuyển vào năm ống thạch mềm tryptone bằng các pipet tiệt trùng riêng biệt.
12. Hai giọt môi trường nuôi cấy dinh dưỡng của vi khuẩn (Ví dụ: Escherichia coli B) được truyền vô trùng, tốt nhất là trong buồng chảy tầng, đến mỗi ống thạch mềm tryptone có chứa vi khuẩn ở năm nồng độ khác nhau (10 -5 đến 10-9 ).
13. Nội dung của năm ống thạch mềm tryptone có chứa vi khuẩn và vi khuẩn được trộn nhanh chóng bằng cách xoay giữa lòng bàn tay.
14. Các nội dung được đổ vô trùng trên năm đĩa thạch cứng tryptone có nhãn 10 -5 đến 10 -9, do đó tạo thành một chuẩn bị nuôi cấy hai lớp. Các tấm được xoay nhẹ nhàng và cho phép cứng.
15. Các tấm được ủ ở vị trí đảo ngược ở 37 ° C trong tủ ấm.
Quan sát:
1. Tất cả các tấm được quan sát cho các đơn vị hình thành mảng bám (PFU) phát triển thành vùng rõ ràng trên bãi cỏ của vi khuẩn.
2. Chỉ những tấm có PFU trong khoảng từ 30 đến 300 mới được xem xét để liệt kê phage. Số lượng PFU trên mỗi tấm được tính. Các tấm hiển thị lớn hơn 300 PFU được chỉ định 'quá nhiều để đếm' (TNTC), trong khi các tấm hiển thị dưới 30 PFU được chỉ định 'quá ít để đếm' (TFTC). Những tấm như vậy không được xem xét.
3. Dựa trên các quan sát, số lượng vi khuẩn trên mỗi ml nuôi cấy phage gốc được tính theo công thức sau.
Số phages / ml = Số hệ số pha loãng PFU X
Ví dụ: nếu số lượng PFU là 280 trong độ pha loãng 10 -7, thì số lượng phage trong môi trường nuôi cấy của phage là 280 X 10 7 phage / ml (= 2.80 X 10 9 phage / ml).
