Tái tạo DNA: Lưu ý về sao chép, sửa chữa và tái tổ hợp DNA
Ghi chú về sao chép DNA, sửa chữa và tái hợp!
Tái tạo DNA:
Sao chép DNA bán bảo tồn:
Sao chép DNA là một chức năng tự động của DNA. Nó thường xảy ra trong giai đoạn S của chu kỳ tế bào khi nhiễm sắc thể ở dạng mở rộng cao. Theo đề xuất của Watson và Crick, sao chép DNA là bán bảo thủ.
Trong bản sao bán bảo tồn, hai chuỗi sẽ tách ra khỏi nhau, duy trì tính toàn vẹn của chúng và mỗi chuỗi sẽ tổng hợp, từ nhóm nucleotide, chuỗi bổ sung của nó. Kết quả sẽ là, phân tử mới được tổng hợp sẽ mang hoặc bảo tồn một trong hai sợi từ phân tử mẹ và sợi còn lại sẽ được lắp ráp mới. Có đủ bằng chứng để chứng minh rằng DNA sợi kép thực sự sao chép bằng phương pháp bán bảo tồn.
Thí nghiệm của Meselson và Stahl (1958):
Những công nhân này đã nuôi cấy Escherichia coli trong môi trường chứa đồng vị 15 N. Sau khi chúng được sao chép cho một số thế hệ trong môi trường đó, cả hai chuỗi của DNA này chứa 15 N là thành phần của purin và pyrimidine. Khi những vi khuẩn có 15 N này được chuyển vào môi trường nuôi cấy chứa 14 N, người ta thấy rằng DNA tách ra khỏi thế hệ vi khuẩn mới sở hữu một sợi nặng hơn một sợi khác.
Chuỗi nặng hơn đại diện cho sợi bố mẹ và sợi nhẹ hơn là sợi mới được tổng hợp từ môi trường nuôi cấy, do đó chỉ ra phương pháp sao chép DNA bán bảo tồn và loại trừ cả mô hình tổng hợp và sao chép DNA bảo tồn và phân tán.
Sự sao chép bảo thủ sẽ không tạo ra bất kỳ phân tử DNA nào với hiến pháp lai lai. Nếu sự sao chép bị phân tán thì sẽ có sự dịch chuyển DNA từ nặng sang hướng ánh sáng qua từng thế hệ.
Các nghiên cứu tiếp theo đã xác minh kết luận của Meselson và Stahl rằng sao chép DNA là bán bảo tồn và đã mở rộng nó cho nhiều sinh vật khác bao gồm cả thực vật và động vật bậc cao.
Thí nghiệm tự kỷ của Laun:
Ông đã sử dụng thymine phóng xạ hoặc thymidine tritiated. Bằng cách phát triển E.coli trong môi trường nuôi cấy chứa thymidine tritiated, tính phóng xạ đã được kết hợp trong các phân tử DNA con gái.
Trong autoradiograph, phân tử DNA nhân đôi cho thấy một ngã ba sao chép, điểm tại đó hai chuỗi trở thành bốn. Sau lần sao chép đầu tiên, độ phóng xạ được xem là chỉ được kết hợp trong một trong các chuỗi DNA và cả hai chuỗi được tìm thấy được dán nhãn sau lần sao chép thứ hai. Điều này hỗ trợ các chế độ bán bảo tồn của sao chép DNA.
Các thí nghiệm của JH Taylor sườn trên các mẹo gốc Viciafaba (1957) cũng xác nhận phương pháp sao chép DNA bán bảo tồn.
tôi. Sao chép DNA không liên tục:
Okazaki cho rằng quá trình tổng hợp DNA tiến hành đồng thời trên cả hai chuỗi DNA sử dụng cùng một enzyme DNA polymerase dưới dạng các đoạn nhỏ bị cô lập. Các phân đoạn này được gọi là các mảnh Okazaki và bao gồm 1000-2000 nucleotide. Chúng được nối với nhau bởi enzyme polynucleotide ligase, hoàn thành sự hình thành chuỗi polynucleotide.
Sự tổng hợp DNA không liên tục được hỗ trợ bởi thí nghiệm chụp ảnh phóng xạ tự động.
ii. Tái tạo DNA đơn hướng và hai chiều:
J. Cairns từ các thí nghiệm của mình đã kết luận rằng quá trình tổng hợp DNA bắt đầu tại một điểm cố định trên nhiễm sắc thể và tiến hành theo một hướng, nhưng các thí nghiệm gần đây cho thấy sự sao chép hai chiều.
Levinthal và Cairns đề xuất rằng trong quá trình sao chép, hai sợi không tách rời hoàn toàn trước khi sao chép. Thay vào đó, chúng bắt đầu giải nén ở một đầu và đồng thời các đoạn được giải nén bắt đầu thu hút các cặp nucleotide của chúng. Theo cách này, việc giải nén các chuỗi DNA ban đầu và tổng hợp các chuỗi DNA mới đi cạnh nhau.
DNA polymerase:
DNA polymerase là enzyme chủ yếu của sự sao chép DNA. Hoạt động của nó lần đầu tiên được chứng minh bởi Kornberg vào năm 1956. Nó xúc tác cho việc bổ sung cộng hóa trị của deoxyribonucleotide vào 3′-OH của một nucleotide có từ trước được gọi là mồi.
Enzyme DNA polymerase-1 hiện được coi là enzyme sửa chữa DNA chứ không phải là enzyme sao chép. Enzyme này được biết là có năm vị trí hoạt động, đó là vị trí mẫu, vị trí mồi, vị trí phân cắt 5 '-> 3 hoặc vị trí exonuclease, vị trí nucleoside triphosphate và vị trí 3' -> 5 exonuclease ).
DNA polymerase I:
Nó chủ yếu liên quan đến việc loại bỏ các đoạn mồi RNA khỏi Okazaki hoặc các đoạn tiền chất và lấp đầy các khoảng trống kết quả do khả năng trùng hợp 5 '-> 3 của nó. Enzyme DNA polymerase I cũng có thể loại bỏ các chất làm giảm thymine được tạo ra do chiếu tia UV và lấp đầy khoảng trống do cắt bỏ. Điều này được gọi là chức năng đọc hoặc chỉnh sửa bằng chứng của enzyme này.
DNA polymerase-II:
Enzim này giống với DNA polymerase-I trong hoạt động của nó, nhưng là enzyme sửa chữa DNA và mang lại sự tăng trưởng theo hướng 5 '-> 3,, sử dụng các nhóm 3′-OH tự do.
DNA polymerase-III:
Nó đóng một vai trò thiết yếu trong sao chép DNA. Nó là một enzyme đa phân tử hoặc holoenzyme có mười tiểu đơn vị như α,, ε, θ, г, y, δ, δ ', x và. Tất cả mười tiểu đơn vị này đều cần sao chép DNA trong ống nghiệm; Tuy nhiên, tất cả đều có chức năng khác nhau. Ví dụ, tiểu đơn vị α có hoạt động hiệu đính hoặc chỉnh sửa exonuclease 3 '-> 5. Enzim cốt lõi bao gồm ba tiểu đơn vị - α, và. Còn lại bảy tiểu đơn vị làm tăng quá trình (quá trình có nghĩa là nhanh chóng và hiệu quả mà DNA polymerase mở rộng chuỗi phát triển).
DNA polymerase sinh vật nhân thực:
Eukai yote (ví dụ, nấm men, gan chuột, tế bào khối u ở người) được tìm thấy có chứa năm loại DNA polymerase sau đây:
(i) DNA polymerase α:
Enzyme có trọng lượng phân tử tương đối cao này còn được gọi là polymerase cytoplasmic hoặc polymerase lớn. Nó được tìm thấy cả trong nhân và tế bào chất.
(ii) DNA polymerase:
Enzyme này còn được gọi là polymerase hạt nhân hoặc polymerase nhỏ và chỉ được tìm thấy ở động vật có xương sống.
(iii) DNA polymerase y:
Enzyme này được gọi là polymerase ty thể và được mã hóa trong nhân.
(iv) DNA polymerase:
Enzyme này được tìm thấy trong các tế bào động vật có vú và PCNA phụ thuộc vào quá trình tổng hợp DNA (PCNA = kháng nguyên nhân tế bào tăng sinh).
(v) DNA polymerase:
Nó trước đây được gọi là DNA polymerase 5II. Enzyme này độc lập với PCNA và xuất hiện trong các tế bào HeLa của động vật có vú và nấm men vừa chớm nở.
DNA polymerase lớn a là enzyme DNA polymerase chiếm ưu thế là các tế bào nhân chuẩn và được tin tưởng từ lâu là enzyme duy nhất liên quan đến sự sao chép DNA. Nhưng bây giờ có thêm một loại polymerase, cụ thể là DNA polymerase 8 cũng được tìm thấy có liên quan đến sự sao chép DNA của sinh vật nhân chuẩn.
DNA mồi:
Những enzyme này xúc tác cho quá trình tổng hợp mồi RNA là điều kiện tiên quyết cho sự bắt đầu sao chép DNA ở đại đa số các sinh vật. Trước khi bắt đầu sao chép DNA thực tế, các đoạn RNA oligonucleotide ngắn, được gọi là mồi RNA hoặc đơn giản là mồi, phải được tổng hợp bởi enzyme DNA primase sử dụng triphosphate ribonucleoside.
Đoạn mồi RNA này được tổng hợp bằng cách sao chép một chuỗi cơ sở cụ thể từ một chuỗi DNA và khác với một phân tử RNA điển hình ở chỗ sau khi tổng hợp, đoạn mồi vẫn giữ liên kết hydro với mẫu DNA.
Các mồi có khoảng 10 nucleotide dài ở sinh vật nhân chuẩn và chúng được tạo ra theo các khoảng trên chuỗi trễ, nơi chúng được kéo dài bởi enzyme DNA polymerase để bắt đầu mỗi đoạn okazaki. Những đoạn mồi RNA này sau đó được cắt bỏ và chứa đầy DNA với sự trợ giúp của hệ thống sửa chữa DNA ở sinh vật nhân chuẩn.
Ở vi khuẩn, hai loại enzyme khác nhau được biết là tổng hợp RNA oligonucleotide - RNA polymerase (trên chuỗi dẫn đầu) và DNA primase (trên chuỗi trễ).
Polynucleotide Ligase:
Enzyme này là một enzyme quan trọng cả trong quá trình sao chép DNA và sửa chữa DNA. DNA ligase xúc tác cho sự hình thành liên kết phosphodiester giữa nhóm 5′-phosphoryl của một nucleotide và nhóm 3-OH của người hàng xóm ngay lập tức ở bên cạnh một nick trong chuỗi DNA; do đó, nó niêm phong các nút trong một chuỗi DNA.
Nội sinh:
Endonuclease, đặc biệt là endonuclease hạn chế, cũng rất quan trọng trong quá trình sao chép DNA cũng như sửa chữa DNA. Trong quá trình sao chép DNA, một endounclease có thể tạo ra một nick trong nguồn gốc để bắt đầu sao chép hoặc nó có thể tạo ra các nút để tạo ra một khớp xoay để tạo điều kiện thuận lợi cho DNA.
Enzyme tham gia vào việc mở DNA Helix:
DNA helicase:
DNA helicase là các enzyme tháo gỡ phụ thuộc ATP, thúc đẩy sự phân tách của hai sợi bố mẹ và thiết lập các nhánh sao chép sẽ dần dần di chuyển ra khỏi nguồn gốc. Về nguyên tắc, chuỗi xoắn DNA mẫu tại một ngã ba sao chép về nguyên tắc có thể được xúc tác bởi hai chuỗi xoắn DNA, hoạt động trong buổi hòa nhạc, một chạy dọc theo chuỗi dẫn đầu và chuỗi còn lại dọc theo chuỗi trễ.
Chuỗi làm mất ổn định chuỗi xoắn (còn được gọi là protein liên kết DNA chuỗi đơn hoặc SSBP):
Đằng sau ngã ba sao chép, các chuỗi DNA đơn được ngăn không cho tua lại với nhau (hoặc hình thành các vòng kẹp tóc hai sợi trong mỗi sợi đơn) do tác động của protein SSB. Các protein SSB liên kết với các chuỗi DNA tiếp xúc mà không bao phủ các bazơ, do đó, vẫn có sẵn cho quá trình tạo khuôn.
Topoisomeraes (cụm từ DNA):
Hành động của một helicase giới thiệu một siêu tốc độ dương vào DNA song công trước ngã ba sao chép. Enzyme, được gọi là topoisomeraes, làm thư giãn siêu tốc bằng cách gắn vào song công siêu tốc tạm thời, đặt biệt danh cho một trong các chuỗi và xoay nó qua chuỗi không bị phá vỡ. Các nick sau đó được nối lại.
Một loại topoisomerase (tức là topoisomerase I) gây ra đứt gãy hoặc một chuỗi cho phép hai phần của chuỗi xoắn DNA ở hai bên của nick có thể xoay tự do với nhau, sử dụng liên kết phosphodiester trong chuỗi đối diện với nick như một điểm xoay. Một loại topoisomerase thứ hai (tức là topoisomerase II) tạo thành một liên kết cộng hóa trị cho cả hai chuỗi xoắn DNA cùng một lúc, làm cho sợi đôi bị đứt trong chuỗi xoắn.
Bản sao:
Một bản sao là đơn vị của DNA trong đó các hành vi sao chép riêng lẻ diễn ra, nghĩa là nó có khả năng sao chép DNA độc lập với các phân đoạn DNA khác. Do đó, mỗi bản sao có một nguồn gốc trong đó bản sao được bắt đầu và nó có thể có một điểm cuối tại đó bản sao dừng lại.
Các nhiễm sắc thể của vi khuẩn và virus thường chứa một bản sao / nhiễm sắc thể. Mặc dù phage T, có hai nguồn gốc, một nguồn gốc và một nguồn phụ, nhưng với sự có mặt của nguồn gốc chính, nguồn gốc thứ cấp, theo quy luật, là không có chức năng. Ở E. coli, điểm gốc được xác định là locus oriC di truyền.
Một nguồn gốc prokaryote hoàn chỉnh hỗ trợ ba chức năng sau: (1) bắt đầu sao chép, (2) kiểm soát tần suất của các sự kiện bắt đầu và (3) phân tách các nhiễm sắc thể được sao chép vào các tế bào con.
Nguồn gốc đã được xác định ở vi khuẩn, nấm men, lục lạp và ty thể; đặc điểm chung quan trọng của chúng là chúng giàu A: T có thể rất quan trọng để dễ dàng tháo gỡ trong quá trình sao chép. Nguồn gốc vi khuẩn chứa nhiều vị trí ngắn (<10 bp) khác nhau cần thiết cho chức năng của nó; các trang web này đôi khi được phân tách bằng khoảng cách cụ thể nhưng không phải bởi các trình tự cụ thể. Những vị trí đặc biệt này là cần thiết cho sự liên kết của các protein khác nhau liên quan đến sao chép DNA.
Một số bản sao prokaryote có các vị trí cụ thể, được gọi là terminator, ngăn chặn sự di chuyển của nhân bản ngã ba và do đó, chấm dứt sự sao chép DNA. Nhiễm sắc thể E. coli có hai terminii, được gọi là T 1 và T 2 nằm ở khoảng 100 Kb ở hai bên của điểm mà các bản sao sẽ gặp nhau. Mỗi điểm cuối là cụ thể cho một hướng chuyển động của ngã ba.
T 1 và T 2 được sắp xếp theo cách mà mỗi ngã ba phải vượt qua cái kia để đến điểm cuối cụ thể của nó. Việc chấm dứt sao chép đòi hỏi sản phẩm của gen tus, có thể mã hóa cho một protein nhận ra T và T 2 .
Ở sinh vật nhân chuẩn, mỗi nhiễm sắc thể có một số bản sao (ví dụ: nấm men, 500; Drosophila, 3.500; chuột 25.000; Viciafaba, 35.000). Tại bất kỳ điểm nào trong giai đoạn S, chỉ một số bản sao này trải qua quá trình sao chép; mỗi bản sao dường như được kích hoạt tại một thời điểm cụ thể theo một trình tự cụ thể. Chiều dài của một bản sao nhân chuẩn có thể thay đổi từ 40 Kb trong nấm men và Drosophila đến khoảng 300 Kb ở Vicia.
Số lượng bản sao có thể phát hiện dường như thay đổi theo giai đoạn phát triển và loại tế bào hoặc mô. Điều này được giải thích trên cơ sở nguồn gốc cụ thể của mô để một số nguồn gốc hoạt động trong một số mô, trong khi một số khác hoạt động ở một số mô khác.
Điều này được minh họa bởi Drosophila trong đó các tế bào phôi sớm có số lượng bản sao gấp 10 lần so với tế bào soma trưởng thành. Bằng chứng sẵn có cho thấy rằng các bản sao nhân chuẩn không có terminii.
Độ trung thực của bản sao:
Tỷ lệ lỗi sao chép DNA thấp hơn nhiều so với phiên mã vì cần phải bảo tồn ý nghĩa của thông điệp di truyền từ thế hệ này sang thế hệ tiếp theo. Ví dụ, tỷ lệ đột biến tự phát ở E. coli là khoảng một lỗi trên 10 10 cơ sở được kết hợp trong quá trình sao chép.
Điều này chủ yếu là do sự hiện diện của các dạng tautomeric nhỏ của các bazơ đã thay đổi tính chất ghép cặp cơ sở. Tỷ lệ lỗi được giảm thiểu bởi nhiều cơ chế. DNA polymerase sẽ chỉ kết hợp một nucleotide đến nếu nó tạo thành cặp cơ sở chính xác với nucleotide mẫu trong vị trí hoạt động của nó.
Lỗi thỉnh thoảng được phát hiện bởi exonuclease 3 '-> 5 associated liên quan đến polymerase. Điều này loại bỏ nucleotide không chính xác từ đầu 3′ trước khi kết hợp thêm, cho phép polymerase sau đó chèn đúng bazơ. Để exonuclease hiệu đính hoạt động đúng, nó phải có khả năng phân biệt một cặp cơ sở chính xác với một cặp cơ sở không chính xác.
Khả năng di động tăng lên của các cặp cơ sở 'không được bảo vệ' ở đầu 5′ của các đoạn DNA bị trễ mới được khởi tạo có nghĩa là chúng không bao giờ có thể xuất hiện chính xác và do đó không thể đọc được. Do đó, một số nucleotide đầu tiên là ribonucleotide (RNA) để sau đó chúng có thể được xác định là vật liệu có độ trung thực thấp và được thay thế bằng DNA kéo dài (và hiệu đính) từ đoạn liền kề. Các lỗi thoát hiệu đính được sửa chữa bằng cơ chế sửa chữa không khớp.
Cơ chế sao chép DNA ở Prokaryote:
Sự sao chép DNA in vitro đã được nghiên cứu rộng rãi ở E.coli và trong các phage và plasmid của E. coli. Ở E. coli, quá trình sao chép DNA bao gồm ba bước chính sau:
1. Bắt đầu sao chép DNA:
Quá trình này bao gồm ba bước: (i) nhận biết nguồn gốc (O), (ii) mở song công DNA để tạo ra một vùng DNA sợi đơn và (iii) thu nhận protein Dna B (nghĩa là 5 ′ 3 ′ helicase ; cũng đóng vai trò là chất kích hoạt primase). Do đó, phức hợp ATP Dna-A (hoặc protein khởi đầu) liên kết ở 9 bp vùng lặp lại đảo ngược (R,, R,, R v R 4 ) của ori C của E. coli và thúc đẩy mở song công DNA ở vùng ba lặp lại trực tiếp chuỗi 13 bp (được gọi là 13-mers).
Việc mở xảy ra từ 13-phải sang trái và đòi hỏi các protein khởi tạo DNA và HU hoặc IHF siêu âm. Dna B (-helicase) được chuyển đến DNA sợi đơn bị phơi nhiễm và gây ra sự tháo gỡ DNA với sự hiện diện của protein A TP, SSB và DNA gyrase (một loại topoisomerase).
Điều này dẫn đến việc tháo gỡ song công DNA và sao chép từ ori C tiến hành theo cả hai hướng (hai chiều); Liên kết SSB xảy ra trên các vùng bị mắc kẹt đơn và hai phức hợp Dna B (= primosome) được tải một trên mỗi chuỗi.
2. Độ giãn dài của chuỗi DNA:
Bước này đòi hỏi sự có mặt của các enzyme và các yếu tố sau: 1. Dna B hoặc helicase (còn được gọi là quảng bá di động); 2. primase (Dna G); 3. DNA polymerase holoenzyme (hoặc DNA pol III HE); 4. Protein SSB; 5. RNAase H loại bỏ mồi RNA; 6. DNA polymerase I được sử dụng để lấp đầy khoảng trống được tạo ra do các đoạn mồi RNA và 7. DNA ligase (chuyển đổi các đoạn okazaki không mồi thành chuỗi liên tục). Trong quá trình bắt đầu chuyển tiếp kéo dài, các sự kiện sau đây xảy ra:
(i) Khi helicase (hoặc Dna B) di chuyển theo hướng 5 ′ -> 3, nó tạo ra một ngã ba sao chép bằng cách mở song công DNA.
(ii) Chuỗi DNA có helicase trở thành chuỗi trễ. DNA primase liên kết với Dna B helicase, tạo thành primosome tổng hợp nhiều mồi cho chuỗi trễ và mồi RNA đơn cho chuỗi dẫn đầu.
(iii) Để tổng hợp chuỗi trễ, DNA pol III HE phải hoạt động trên cùng một chuỗi mà Dna B helicase bị ràng buộc, nhưng nó di chuyển theo hướng ngược lại.
(iii) DnaB helicase, Dna Gprimase và DNA pol III FIE phối hợp với nhau trong kéo dài sợi. Quá trình lắp ráp Helicase và DNA polymerase vẫn tiếp tục, nghĩa là, chúng vẫn bị ràng buộc chặt chẽ với ngã ba và bị ràng buộc trong suốt phản ứng.
Tổng hợp (- kéo dài) độ trễ và các sợi dẫn đầu diễn ra bằng các phương pháp hơi khác nhau; nó là phức tạp hơn nhiều cho độ trễ chuỗi so với sợi hàng đầu:
(A) Tổng hợp không liên tục trên chuỗi trễ:
1. Primase được lấy từ dung dịch và được kích hoạt bởi helicase (DnaB) để tổng hợp mồi aRNA (dài 10 đến 20 nt hoặc nucleotide) trên chuỗi trễ.
2. Các đoạn mồi RNA được DNA pol III HE nhận ra trên chuỗi trễ và được sử dụng để tổng hợp các đoạn tiền chất hoặc okazaki. Trên thực tế, mỗi đoạn mồi RNA mới được nhận ra bởi tiểu đơn vị gamma (y) của DNA pol III HE và được nạp với tiểu đơn vị p của cùng một polymerase. Tiểu đơn vị p được tải sẵn này sau đó có thể thu được lõi của DNA poly III HE khi nó trở nên khả dụng sau khi hoàn thành công việc tổng hợp của nó trên đoạn okazaki trước đó.
3. Khi hoàn thành các đoạn okazaki, các đoạn mồi RNA được DNA polymerase 1 cắt bỏ, sau đó lấp đầy các khoảng trống kết quả với DNA.
4. Sau khi DNA polymerase tôi thêm các deoxyribonucleotide cuối cùng vào khoảng trống còn lại của đoạn mồi đã bị cắt bỏ, enzyme DNA ligase sẽ tạo ra liên kết phosphodiester liên kết đầu 3 free của chất thay thế mồi với đầu 5 của đoạn okazaki.
(B) Tổng hợp liên tục trên sợi dẫn đầu:
1. Trong sao chép DNA hai chiều, chuỗi đầu được mồi một lần trên mỗi chuỗi của bố mẹ.
2. Đoạn mồi RNA của chuỗi dẫn đầu được tổng hợp bởi enzyme RNA polymerase.
3. DNA pol III HE gây ra sự kéo dài của chuỗi đầu và cuối cùng là enzyme DNA pol 1 và ligase mang lại cảm giác cuối cùng cho chuỗi dẫn đầu như trong trường hợp chuỗi bị trễ.
Sao chép DNA ở sinh vật nhân chuẩn :
Sự sao chép DNA của sinh vật nhân chuẩn đòi hỏi hai enzyme DNA polymerase khác nhau, đó là DNA polymerase a và DNA polymerase. DNA polymerase δ tổng hợp DNA trên chuỗi dẫn đầu (tổng hợp DNA liên tục), trong khi DNA polymerase a tổng hợp DNA trên chuỗi trễ (tổng hợp DNA không liên tục). Bên cạnh hai enzyme này, sao chép DNA: (1) kháng nguyên T; (2) hệ số sao chép A hoặc RF-A (còn được gọi là RP-A hoặc SSB nhân chuẩn); (3) topoisomerase I; (4) topoisomerase II; (5) tăng sinh - kháng nguyên hạt nhân tế bào (PCNA, còn được gọi là cyclin) và (6) yếu tố sao chép Cor RF-C.
Quá trình sao chép DNA của sinh vật nhân chuẩn bao gồm các bước sau:
1. Trước khi bắt đầu tổng hợp DNA, có giai đoạn tổng hợp thời gian 8-10 phút để hình thành phức hợp DNA không liên kết. Bước này chỉ cần ba protein tinh khiết là kháng nguyên T (T-ag hoặc kháng nguyên khối u), RF-A và topiosomeraes I và II.
2. Kháng nguyên T, sử dụng miền liên kết DNA của nó, tạo thành một phức hợp đa tiểu đơn vị với vị trí I và vị trí II với sự hiện diện của A TP và gây ra sự tháo gỡ cục bộ.
3. Việc mở rộng song công mở rộng hơn xảy ra do sự liên kết của RF-A và topoisomerase với - sự trợ giúp của thành phần helicase DNA của Topoisomera T-trước giúp tháo gỡ DNA bằng cách thay đổi cấu trúc liên kết DNA ở ngã ba sao chép.
4. Các protein RF-A hoặc SSB liên kết với các chuỗi DNA đơn lẻ.
5. Quá trình tổng hợp RNA mồi được thực hiện bởi primase liên kết chặt chẽ với DNA polymerase ex.
6. DNA polymerase a giúp tổng hợp một đoạn okazaki theo hướng 5 ′ đến 3.
7. Yếu tố sao chép C (hoặc RF-C) và PCNA (cyclin) giúp chuyển đổi các polymerase DNA để pol a được thay thế bằng pol 5 sau đó liên tục tổng hợp DNA trên chuỗi dẫn đầu.
8. Một đoạn okazaki khác sau đó được tổng hợp từ ngã ba sao chép trên chuỗi trễ bằng phức hợp pol a - primase và bước này được lặp đi lặp lại nhiều lần, cho đến khi toàn bộ phân tử DNA được bao phủ.
9. Các đoạn mồi RNA được loại bỏ và các khoảng trống được lấp đầy như trong quá trình sao chép DNA của prokaryote.
Gần đây, vai trò của DNA polymerase e trong sao chép DNA đã được nhấn mạnh, do đó ba loại DNA polymerase (a, và) hiện được biết là có liên quan đến sao chép DNA của sinh vật nhân chuẩn. A. Sugino và đồng nghiệp đã đề xuất rằng DNA polymerase có thể hoạt động ở cả hai chuỗi dẫn đầu và tụt lại (vì polymerase a có hoạt động primase α), trong khi polymerase e và polymerase 5 có liên quan đến sự kéo dài của các chuỗi dẫn và trễ tương ứng.
Cơ chế sửa chữa và hư hỏng DNA
Các loại thiệt hại DNA:
1. tổn thương DNA:
Một sự thay đổi trong cấu trúc hóa học hoặc vật lý bình thường của DNA được gọi là tổn thương DNA. Nhiều tác nhân ngoại sinh, chẳng hạn như hóa chất và phóng xạ, có thể gây ra thay đổi vị trí của các nguyên tử nitơ và carbon trong hệ thống vòng dị vòng của các bazơ và một số nhóm chức ngoại bào (ví dụ, nhóm keto và amino của các bazơ).
Điều này có thể dẫn đến mất cặp ghép cơ sở hoặc ghép cặp cơ sở bị thay đổi (ví dụ: A thay đổi có thể ghép cặp với C thay vì T). Nếu một tổn thương như vậy được cho phép ở lại DNA, một đột biến có thể trở nên cố định trong DNA bằng cách gây đột biến trực tiếp hoặc gián tiếp.
Ngoài ra, sự thay đổi hóa học có thể tạo ra một biến dạng vật lý trong DNA, ngăn chặn sự sao chép và / hoặc phiên mã, gây chết tế bào. Do đó, các tổn thương DNA có thể gây đột biến và / hoặc gây chết người. Một số tổn thương là tự phát và xảy ra do phản ứng hóa học vốn có của DNA và sự hiện diện của các loài hóa học phản ứng bình thường trong tế bào.
Ví dụ, cytosine cơ sở trải qua quá trình khử thủy phân tự phát để cung cấp uracil. Nếu không được sửa chữa, uracil thu được sẽ tạo thành một cặp cơ sở với adenine trong quá trình sao chép tiếp theo, dẫn đến đột biến điểm. Sự khử màu là một phản ứng thủy phân tự phát khác liên quan đến sự phân tách liên kết N-glycosylic giữa N-9 của các cơ sở purine A và G và C-l 'của đường deoxyribose và do đó làm mất các cơ sở purine từ DNA. Xương sống đường phốt phát của DNA vẫn còn nguyên. Trang web apurinic kết quả là một tổn thương không mã hóa, vì thông tin được mã hóa trong các cơ sở purine bị mất.
2. Thiệt hại oxy hóa:
Điều này xảy ra trong điều kiện bình thường do sự hiện diện của các loại oxy phản ứng (ROS) trong tất cả các tế bào hiếu khí, ví dụ như superoxide, hydro peroxide và quan trọng nhất là gốc hydroxyl (OH). Gốc này có thể tấn công DNA, I tại một số điểm, tạo ra một loạt các sản phẩm oxy hóa có tính chất II bị thay đổi, ví dụ 8-oxoguanine, 2-oxoadenine và 5-formyluracil. Mức độ của những thứ này có thể được tăng lên bởi các gốc hydroxyl từ sự phóng xạ của nước gây ra bởi bức xạ ion hóa.
3. Sự kiềm hóa:
Các tác nhân kiềm hóa là các hóa chất điện di, dễ dàng thêm các nhóm alkyl (ví dụ methyl) vào các vị trí khác nhau trên các axit nucleic khác biệt với các methyl hóa bởi các enzyme biến đổi thông thường. Ví dụ phổ biến là methylmethane sulfonate (MMS) và ethylnitrosourea (ENU).
Các ví dụ điển hình của các bazơ đã methyl hóa là 7-methylarinine, 3-methyl-adenine, 3- methylarinine và 0 6 -methylguanine. Một số trong những tổn thương này có khả năng gây tử vong vì chúng có thể can thiệp vào việc tháo gỡ DNA trong quá trình sao chép và sao chép. Hầu hết cũng gián tiếp gây đột biến; tuy nhiên, 0 6 -methylarinine là một tổn thương gây đột biến trực tiếp vì nó có thể kết hợp với thymine trong quá trình sao chép.
4. Cồng kềnh:
Các dimer cyclobutane pyrimidine được hình thành bởi ánh sáng cực tím từ các pyrimidine liền kề trên một sợi bằng cách chu kỳ các nguyên tử carbon C5 và C6 liên kết đôi của mỗi cơ sở để tạo ra vòng xyclobutane. Việc mất cặp đôi cơ sở với chuỗi đối diện gây ra sự biến tính cục bộ của DNA tạo ra một tổn thương cồng kềnh sẽ phá vỡ sự sao chép và sao chép. Một loại dimer pyrimidine khác, 6, 4 photop sinh, là kết quả của sự hình thành liên kết giữa C6 của một cơ sở pyrimidine và C4 của cơ sở liền kề.
Khi benzo carcinogen benzo [a] pyrene được chuyển hóa bởi cytochrom P-450 trong gan, một trong những chất chuyển hóa của nó (một diol epoxide) có thể liên kết hóa trị với nhóm 2-amin của dư lượng guanine. Nhiều chất arylating thơm khác tạo thành các cộng hóa trị với DNA. Chất gây ung thư gan aflatoxin B, cũng liên kết cộng hóa trị với DNA.
Sửa chữa DNA:
Các hệ thống sửa chữa nhận ra một loạt các thay đổi trong DNA để bắt đầu hành động. Một tế bào có thể có một số hệ thống để đối phó với thiệt hại DNA. Các hệ thống này bao gồm: (1) Sửa chữa trực tiếp, (2) Sửa chữa cắt bỏ (3) Sửa chữa không phù hợp, (4) Hệ thống dung sai và (5) Hệ thống truy hồi.
1. Sửa chữa trực tiếp:
Việc đảo ngược hoặc loại bỏ đơn giản thiệt hại cho DNA được gọi là sửa chữa trực tiếp, ví dụ, loại bỏ các liên kết cộng hóa trị giữa hai 4 và hai 5 carbons của hai dư lượng thymine tham gia vào sự hình thành các chất làm giảm thymine.
Các chất làm giảm thymine thường được hình thành do chiếu xạ UV và cản trở sự sao chép và sao chép. Kelner (1949) đã quan sát thấy rằng số lượng lớn vi khuẩn có thể sống sót với liều lượng lớn bức xạ UV; nếu chúng được tiếp xúc với một nguồn ánh sáng nhìn thấy mạnh mẽ.
Hiện tượng này được gọi là kích hoạt quang. Sau đó, người ta đã chứng minh rằng trong quá trình chiếu xạ UV, một loại enzyme đặc biệt được liên kết chọn lọc với DNA của vi khuẩn. Trong quá trình kích hoạt quang, enzyme được kích hoạt bởi ánh sáng nhìn thấy. Nó cắt các bộ điều chỉnh thymine, do đó khôi phục chúng về dạng ban đầu. Quá trình sửa chữa này là trung gian enzyme và phụ thuộc vào ánh sáng.
2. Sửa chữa cắt bỏ:
Trong cơ chế sửa chữa này, đoạn DNA bị hỏng hoặc bị thay đổi được cắt bỏ và một bản vá DNA mới được tổng hợp tại vị trí của nó. Mặc dù các hệ thống sửa chữa cắt bỏ khác nhau về tính đặc hiệu của chúng, con đường chính bao gồm ba bước sau:
(i) Công nhận và vết mổ:
Phần bị hỏng / bị thay đổi của một chuỗi DNA được nhận ra bởi một endonuclease; Enzyme này sau đó cắt các sợi bị ảnh hưởng trên cả hai mặt của thiệt hại.
(ii) Cắt bỏ:
Một 5 ′ -> 3 ′ exonuclease (DNA polymerase I) tiêu hóa phần bị hư hỏng / bị thay đổi; điều này tạo ra một vùng đơn trong chuỗi xoắn kép DNA.
(iii) Tổng hợp:
Trong bước này, vùng sợi đơn được tạo ra bởi sự cắt bỏ đóng vai trò là khuôn mẫu cho DNA polymerase tổng hợp sự thay thế cho đoạn bị cắt bỏ. DNA ligase sau đó niêm phong nick còn lại sau khi tổng hợp thay thế cho phần bị cắt bỏ.
Ở E.coli, sự cắt bỏ rất có thể là do hoạt động exonuclease 3 ′ -> 5 ′ của DNA polymerase I, trong khi quá trình tổng hợp được thực hiện nhờ hoạt động 5 ′ -> 3 ′ polymerase của cùng một enzyme. Các hệ thống sửa chữa cắt bỏ là khá phổ biến cả ở sinh vật nhân sơ và sinh vật nhân chuẩn. Một số hệ thống này nhận ra thiệt hại chung đối với DNA, trong khi các hệ thống khác rất cụ thể, ví dụ, endonuclease AP loại bỏ dư lượng ribose khỏi các vị trí khử. Sửa chữa cắt bỏ liên quan đến độ dài khác nhau của DNA và được nhóm thành ba lớp sau:
(a) Sửa chữa bản vá rất ngắn (VSP):
Hệ thống này liên quan đến việc sửa chữa sự không phù hợp giữa các cơ sở cụ thể.
(b) Sửa chữa bản vá ngắn:
Trong hệ thống này, khoảng 20 chuỗi DNA dài được cắt bỏ và các thiệt hại được sửa chữa thông qua các gen uvr (uvr, A, B, C, của E.coli), mã hóa cho các thành phần của một endonuclease sửa chữa. Một enzyme uvr D khác cũng cần thiết cho hoạt động của helicase.
(c) Sửa chữa bản vá dài:
Hệ thống này liên quan đến việc cắt bỏ khoảng 1500 phân đoạn dài, nhưng đôi khi phân đoạn bị cắt có thể> 9000 cơ sở. Nó ít phổ biến hơn nhiều và phải được gây ra bởi thiệt hại ngăn chặn sự sao chép. Ở E. coli, hệ thống này cũng liên quan đến gen uvr và DNA polymerase I.
3. Sửa chữa không phù hợp:
Nó liên quan đến việc điều chỉnh sự không phù hợp hoặc ghép nối giữa các cơ sở không bổ sung. Sự không phù hợp có thể phát sinh (a) trong quá trình sao chép hoặc (b) do sự thay đổi cơ sở (ví dụ, sự khử amin của cytosine thành uracil) và dẫn đến biến dạng cấu trúc trong chuỗi xoắn kép của DNA. Những sự thay thế này được xử lý trong E. coli bằng hệ thống sửa chữa cắt bỏ rất ngắn được mô tả dưới đây.
Hệ thống sửa chữa không phù hợp ở E. coli:
Khi có một sự không phù hợp trong một cặp cơ sở như trong GC -> GT, về mặt lý thuyết, nó có thể sửa chữa để tạo ra loại hoang dã (GC) hoặc loại đột biến (AT). Do đó, hệ thống sửa chữa phải phân biệt giữa sợi cũ và sợi mới và chỉ sửa chữa sợi mới để khôi phục kiểu hoang dã.
Điều này được thực hiện bởi hệ thống sửa chữa cắt bỏ rất ngắn và yêu cầu bốn protein là Mut L, Mut S, Mut U và Mut H được mã hóa lần lượt bằng E. coli bởi các gen mut L, mut S, mut U và mut H. Các lỗi không khớp sản xuất trong quá trình sao chép được sửa chữa bởi hệ thống sửa chữa đập.
Đập gen của E. coli tạo ra một methylase làm methyl hóa adenine của chuỗi GATC trên cả hai chuỗi DNA. Sự sao chép của một chuỗi GATC bị methyl hóa hoàn toàn tạo ra một chuỗi hemimetyl hóa trong đó dư lượng A trong các chuỗi mới được tổng hợp là không bị methyl hóa.
Trạng thái không bị methyl hóa của chuỗi mục tiêu này được sử dụng để xác định chuỗi mới; các cơ sở xung quanh vị trí không phù hợp trong chuỗi mới được cắt bỏ và một sự thay thế được tổng hợp. Hệ thống này bao gồm các sản phẩm của gen mut L, mut S, mut H và uvr D.
Sửa chữa hệ thống truy hồi:
Các hệ thống này còn được gọi là 'sửa chữa sau sao chép' hoặc 'sửa chữa tái tổ hợp'. Trong E.coli, hệ thống sửa chữa này dựa trên gen rec A tạo ra protein Rec A. Rec Một chức năng protein trong việc trao đổi các chuỗi giữa các phân tử DNA trong quá trình tái tổ hợp di truyền và cũng có chức năng trong việc trao đổi chuỗi đơn trong quá trình sửa chữa tái hợp. Dường như có hai con đường rec A, một con liên quan đến gen rec B, C và con đường khác liên quan đến rec F.
Hệ thống sửa chữa này hoạt động khi một biến dạng cấu trúc ngăn chặn sao chép tại vị trí bị hư hỏng. Ví dụ, các đột biến E. coli bị thiếu trong sửa chữa cắt bỏ sẽ không thể loại bỏ các chất làm giảm thymine. Trong tình huống như vậy, việc nhân rộng tiến hành bình thường lên đến các vị trí bị hư hỏng; DNA polymerase ngăn chặn sự sao chép của chuỗi bị ảnh hưởng và tái tạo sự sao chép bỏ qua vị trí bị hư hại.
Chuỗi bổ sung được sao chép bình thường tại vị trí bị hư hỏng trong chuỗi khác. Do đó, sao chép tạo ra một thế hệ con bình thường của phân tử DNA và một phân tử có chất làm giảm thymine trong một sợi và một khoảng cách dài trong chuỗi bổ sung của nó. Phân tử DNA con cháu với thymine dimer sẽ bị mất trừ khi nó được sửa chữa bằng cách lấp đầy khoảng trống trong một trong các chuỗi của nó.
Điều này đạt được bằng cách trao đổi sợi đơn giữa hai phân tử DNA con cháu; vùng trao đổi lấp đầy khoảng trống và được tạo ra bởi protein Rec A. Kết quả của sự trao đổi này, phân tử con cháu bình thường có một vùng sợi đơn có một khoảng cách. Khoảng cách này được sửa chữa bằng tổng hợp DNA.
Hệ thống dung sai:
Các hệ thống này xử lý các thiệt hại ngăn chặn sao chép bình thường tại vị trí bị hư hỏng có thể bằng cách cho phép sao chép các vị trí bị hỏng với tần suất lỗi cao. Các hệ thống này có thể đặc biệt quan trọng ở sinh vật nhân chuẩn nơi kích thước bộ gen rất lớn và do đó việc sửa chữa hoàn toàn thiệt hại là khá khó xảy ra.
